RNA velocity为何“反向”？TIVelo改进scVelo的轨迹方向推断
在单细胞轨迹分析中，RNA velocity常被用来预测细胞未来的状态。我们通常会在 UMAP 上看到一组箭头，箭头方向代表细胞可能的状态转移方向。然而在实际分析中，RNA velocity的结果并不总是稳定。尤其是在复杂分化过程、多分支轨迹、成熟细胞状态或疾病状态转变中，velocity stream有时会出现方向不符合生物学预期，甚至出现轨迹反转的问题。
2025年7月发表在 Nature Communications的论文TIVelo: RNA velocity estimation leveraging cluster-level trajectory inference，正是针对这一问题提出了TIVelo方法。它不是简单地替换 scVelo 的某一个参数，而是改变了velocity推断的逻辑顺序：先判断 cluster 层面的主方向，再估计单细胞层面的速度。
RNA速率的假设与反向原因
ODE假设
经典的 RNA velocity 方法，假设一个基因的表达变化可以用下图的两个常微分方程ordinary differential equation (ODE) 描述：
图片来源：https://doi.org/10.1101/2022.02.12.480214
其中：
ODE 假设：α、β、γ 在整个时间窗口内是常数（不随 t 变化），认为RNA产生和消耗过程是线性且平滑的。
违背ODE假设的MURK genes
MURK genes，全称multiple rate kinetics genes，是指那些在细胞发育过程中转录速率 α 并不恒定，而是在某些阶段突然升高的基因。
对于这类基因，unspliced和spliced RNA的关系不再像传统模型假设的那样平滑变化，而可能呈现更复杂的局部动态（如下图b）。当这些基因被用于velocity聚合时，它们可能把细胞推测指向错误的未来状态，最终导致整体 velocity stream 出现反向（如下图d，scVelo的推测出现反向）。
因此，TIVelo为了避免简单ODE 假设无法捕捉复杂转录模式的问题，先在细胞簇层面通过轨迹推断确定大的方向，再用这个方向约束单细胞RNA velocity的估计。
TIVelo的分析步骤
1 主路径选择
main path selection
TIVelo 先把细胞聚成 cluster，然后构建类似 PAGA 的 cluster graph。每个节点代表一个细胞簇，边代表细胞簇之间的连接关系。
TIVelo 会在 cluster graph 中选择一条覆盖尽可能多细胞的主路径。这个路径代表数据中最主要的状态转移方向。
图片来源：https://doi.org/10.1038/s41467-025-61628-x
2 方向判断
orientation inference
这是TIVelo关键的创新点，基于转录的特性：U (unspliced RNA) 应该比 S (spliced RNA) 更早升高，也更早下降。因此沿着轨迹，TIVelo在短拟时间区间内计算 orientation score，如果相对于呈现“更早升高、更早降低”的模式，那么这个方向更可能是正确方向；如果相反，则说明轨迹方向可能需要反转。论文指出这可以避免显式指定和的ODE假设，因为在实际数据集中假设不一定成立。
图片来源：https://doi.org/10.1038/s41467-025-61628-x
3 速率估计
RNA velocity estimation
在确定cluster层面的方向后，TIVelo为每个细胞构建有向最近邻（如下图h），即 directed nearest neighbor (dNN)。然后让每个细胞的 velocity vector 指向这些近未来细胞的平均表达状态。
图片来源：https://doi.org/10.1038/s41467-025-61628-x
与scVelo, UniTVelo, veloVI
等其他模型对比
作者将TIVelo与其他最近的 RNA velocity模型做了横向对比，对比指标包括：
velocity stream图
TIVelo的velocity流向在多数数据集更符合生物学预期方向，而其他方法在某些分支或复杂轨迹上出现方向反转或偏离（下图蓝色框和红色框所示）。
图片来源：https://doi.org/10.1038/s41467-025-61628-x
定量指标
衡量方向是否正确的cross‑boundary direction correctness (CBDir), transition cosine similarity (TransCosine) ，以及衡量箭头的长短是否反映基因真正的变化量的velocity coherence (VeloCoh)。TIVelo在这些指标上的平均表现优于其他方法：
图片来源：https://doi.org/10.1038/s41467-025-61628-x
TIVelo的价值与研究启发
TIVelo 在 MURK genes、复杂多分支轨迹中优势明显，TIVelo不仅是理论上的改进，也在实际数据中比 scVelo、UniTVelo、veloVI 更稳健。
对于发育过程、多分支分化或者疾病进程中复杂的细胞状态转变，TIVelo 提供了一个更稳健的工具来判断细胞状态方向，并帮助识别哪些基因的动态可能导致反向或混乱的 velocity。
最后，TIVelo 不仅是一个改进的计算方法，更提醒我们：在 RNA velocity 分析中，方向正确性依赖于对基因动力学、簇级轨迹和 MURK genes 的理解，而不仅仅是漂亮的箭头。
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参考文献：
[1] Ge, M., Miao, J., Qi, J. et al. TIVelo: RNA velocity estimation leveraging cluster-level trajectory inference. Nat Commun 16, 6258 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-61628-x
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